William Louis Petersen est né le 21 février 1953 à Evanston (Illinois). Il est le dernier d'une famille de 6 enfants. Sportif, il décroche une bourse pour l'université ou il se découvre une passion pour le théâtre.

C'est en interprétant le rôle de Stanley Kowalski dans "Un tramway nommé désir" sur les planches, qu'il est remarqué par le réalisateur William Friedkin qui l'engage dans son film "Police Fédérale Los Angeles" en 1985. Son personnage de flic ripoux sera l'un des rôles les plus marquant de sa carrière au cinéma.

Il jouera également Will Graham, profiler au FBI, dans le film "Le sixième sens". Ce sera le premier volet des aventures d'Hannibal Lecktor, le tueur en série du célèbre roman de Thomas Harris : "Dragon Rouge".

C'est en 2000, qu'il connaîtra la consécration grâce à son personnage de Gil Grissom, entomologiste et chef de la police scientifique à Las Vegas dans la série "Les Experts" dont il est également l'un des producteurs.

En 2006, il fera un break pour revenir à ses premiers amours : le théâtre, dans la pièce "Dublin Carol". Il quitte CSI en 2009 en tant qu'acteur mais reste co-producteur de la série.

Côté vie privée, il a une fille, Maïté, née en 1975 d'un premier mariage. Il l'a prénomé ainsi,  en souvenir d'un séjour au Pays Basque Espagnol (Maïté veut dire Aimée en basque). Elle lui a donné un petit-fils, Mazrik William.  Depuis 2003, William Petersen est remarié avec Gina Cirone, une prof de biologie.